Charakter aktivity:  Nezávislý výskum a vývoj

Žiadateľ: UK Bratislava  

Aktivita je realizovaná v rámci 15% flexibility  

 

Cieľ aktivity:  

Cieľ 2.1: Identifikácia hlavných histomorfologických zmien, ktoré u pacientov s COVID19 spôsobili závažné komplikácie a smrť a ktoré je možné modelovať experimentálne na  animálnych modeloch.  

Cieľ 2.2: Korelácia nálezov u pacientov a  známych animálnych modelov so zameraním sa na zápalovú odpoveď organizmu (model sepsy, pneumónie) a modifikácia animálnych modelov  

Cieľ 2.3: Hodnotenie funkčných zmien kardiovaskulárneho systému v relevantných animálnych experimentoch.   

 

Opis výskumno-vývojovej aktivity projektu:  

Identifikácia hlavných histomorfologických zmien u pacientov s COVID19

Aktivita sa zameria na  posúdenie zmien, ktoré u pacientov ktorí zomreli v súvislosti s infekciou SARS-CoV-2 predstavovali najzávažnejšie komplikácie vedúce k ich smrti.  Hlavnou úlohou je identifikácia zmien, ktoré je možné modelovať v animálnych experimentoch. Analýza pacientov doteraz pitvaných na našom pracovisku ukazuje, že vekom a komorbiditami podobní pacienti majú často výrazne odlišný priebeh infekcie. Naše analýzy ukazujú nielen odlišný stupeň poškodenia tkanív, ale aj postihnutie rôznych orgánov. V súčasnosti akceptované rizikové faktory preto nedokážu spoľahlivo tieto rozdiely vysvetliť.

Pristúpime k podrobnému histologickému hodnoteniu vzoriek postihnutých tkanív (pľúca, srdce, pečeň, slezina, obličky). Zameriame sa na presnú charakterizáciu poškodenia tkanív a buniek priamo infikovaných SARS-CoV-2, ako aj cievnych zmien. S použitím imunohistochemického farbenia zhodnotíme distribúciu a kvantifikujeme markery zápalovej aktivácie, ako aj regulačných mechanizmov reparačných zmien v tkanive.  

Využitie animálnych modelov so zameraním sa na zápalovú odpoveď organizmu (model sepsy, pneumónie)

V rámci predchádzajúcich projektov APVV a VEGA sme zaviedli rôzne animálne modely sepsy. Možno ju indukovať intraperitoneálnou aplikáciou lipopolysacharidu, uropatogénnej E. coli alebo iných patogénov. Klinicky relevantný je ale model polymikrobiálnej peritonitídy a následnej sepsy pomocou cekálnej ligácie a punkcie. Tieto modely v rôznych časových odstupoch a s rôznou interindividuálnou variabilitou indukujú hyperaktiváciu imunitného systému a septický šok s diseminovanou intravaskulárnou koaguláciou. Stav sa podobá v literatúre popísaným stavom pacientov s ťažkou formou COVID19. Podobne ako u pacientov aj septických myší možno dokázať multiorgánové zlyhanie postihujúce najmä obličky, pľúca, ale aj gastrointestinálny trakt. V projekte budeme analyzovať morfologické zmeny indukované v rámci septických modelov u myší v rôznych časových bodoch.  Podobným spôsobom budeme analyzovať aj vzorky zo zvierat s indukovanou pneumóniou. Aplikácia lipopolyscharidu do trachey možno považovať za najčastejšie využívaný model ARDS. Bronchopneumóniu, ktorá tiež vedie k ARDS, môžeme modelovať pomocou intratracheálnej aplikácie S. pneumoniae, S. aureus alebo P. aeruginosa. Výstupným parametrom je okrem mortality aj kultivácia baktérií z bronchoalveolárnej laváže. Tento model máme tiež zavedený a jeho realizácia je možná hneď po začiatku projektu.

Cieľom je stanoviť popri funkčných zmenách na tkanivách aj vybrané biochemické parametre, ktoré majú výpovednú hodnotu k poškodeniu pľúcneho parenchýmu, miere rozvoja oxidačného stresu v tkanive, ale aj systémové zmeny prejavujúce sa zmenami zaznamenanými v plazme.   

Hodnotenie funkčných zmien kardiovaskulárneho systému

Cieľom je stanoviť funkčné zmeny cievnej steny pomocou cievnej myografie skúmaním kontrakčných odpovedí vyvolaných norepinefrínom a serotonínom u izolovaných artérií (a. pulmonalis, a. femoralis, a. renalis aa. mesenterica) u relevantných animálnych modeloch komplikácií COVID-19. Detailná analýza zmien kontrakčných odpovedí bude stanovená pomocou inhibície cyklooxygenázy 1 a cyklooxygenázy 2 a porovnaním inhibície a aktivácie Ca2+-dependentných Cl-kanálov. Naviac u obéznych a diabetických animálnych modeloch komplikácií COVID-19 bude stanovené pôsobenie inhibície a aktivácie β3-adrenergických receptorov na norepinefrínom-vyvolané kontrakcie uvedených izolovaných ciev.  

 

Základné míľniky výskumnej aktivity:  

Míľnik M 2.1  Základná analýza a interpretácia histologických nálezov a histologických a imunohistochemických markerov zápalovej aktivácie ako aj regulačných mechanizmov reparačných zmien v tkanive, u pacientov ktorí zomreli v priamej súvislosti s infekciou SARS-CoV-2

Míľnik M 2.2 Identifikácia vhodných animálnych modelov sepsy s korelátom ku COVID-19.

 

Základné výsledky výskumnej aktivity:

Výsledok V2.1 Identifikácia kľúčových poškodení, ktoré viedli k úmrtiu pacientov s COVID-19  

Výsledok V2.2  Korelácia s animálnymi modelmi a identifikácia vhodných animálnych modelov použiteľných pri štúdiu komplikácií COVID-19  

Výsledok V2.3 Vyhodnotenie kontrakčných odpovedí izolovaných pľúcnych, femorálnych, mezenterických a renálnych artérií u relevantných animálnych modeloch

Výsledok V2.4 Vyhodnotenie vplyvu inhibície cyklooxygenázy 1 a cyklooxygenázy 2 v norepinefrínom a serotonínom vyvolanej kontrakcii uvedených izolovaných artérií  

Výsledok V2.5 Vyhodnotenie vplyvu inhibície a aktivácie Ca2+-dependentných Cl–kanálov na norepinefrínom a serotonínom vyvolanej kontrakcii uvedených izolovaných artérií  

Výsledok V2.6 Vyhodnotenie vplyvu inhibície a aktivácie β3-adrenergických receptorov na norepinefrínom-vyvolané kontrakcie uvedených izolovaných ciev u relevantných obéznych animálnych modeloch  

Výsledok V2.7 Porovnanie zápalových markereov a markerov oxidačného stresu v pľúcnom tkanive a plazme testovaných animálnych modelov